曾經(jīng)是2009年最值得關(guān)注的技術(shù)。

遺傳上除了ATGC這四種堿基，人們對(duì)第五種堿基-甲基化的胞嘧啶的興趣也日益增加。甲基化修飾的存在對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控起了重要作用，異常的甲基化往往是許多疾病的起因。既然如此重要，系統(tǒng)繪制甲基化組的方法自然也多了起來。甲基化組（methylome）這個(gè)詞還不太常見，它指的是全基因組范圍內(nèi)的甲基胞嘧啶。美國(guó)Salk生物研究院的Joseph Ecker及其同事剛剛通過高通量測(cè)序的方法，展現(xiàn)了一張人胚胎干細(xì)胞中所有甲基胞嘧啶的完整圖譜。這是第一張單堿基分辨率的哺乳動(dòng)物甲基化圖譜，并伴隨著mRNA和小RNA以及一些組蛋白修飾的比較分析。他們發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞中近四分之一的甲基化是在非CG背景下，暗示胚胎干細(xì)胞采用不同的甲基化機(jī)制來影響基因調(diào)控。隨著ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，非CG甲基化消失，而在iPSC中還原。這張圖譜為未來人類疾病和發(fā)育中的表觀遺傳學(xué)修飾研究打下了基礎(chǔ)。美國(guó)Whitehead研究院的Meissner等也曾繪制了類似的圖譜。他們利用高通量的亞硫酸氫鹽測(cè)序和單分子測(cè)序，產(chǎn)生了覆蓋大部分CpG島的DNA甲基化圖譜。他們發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化模式與組蛋白甲基化模式的相關(guān)性比基因組序列更好；CpG的甲基化是動(dòng)態(tài)的表觀遺傳標(biāo)志，在細(xì)胞分化期間經(jīng)歷大量的改變。他們還發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞和原代細(xì)胞中與發(fā)育調(diào)控相關(guān)的“弱”CpG島在體外增殖期間經(jīng)歷了異常的超甲基化，讓人想起某些原發(fā)腫瘤。另外，兩個(gè)獨(dú)立的研究小組，分別為哈佛大學(xué)的George Church等，以及加州大學(xué)的Kun Zhang連同弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的Yuan Gao等，也將傳統(tǒng)的甲基化工具如DNA的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化與目標(biāo)基因組捕獲技術(shù)和高通量測(cè)序相結(jié)合，定量測(cè)定人基因組中的甲基化。盡管這些甲基化圖譜的繪制方法略有不同，但他們都采用了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，并在隨后的擴(kuò)增步驟中轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。雖然很有效，但這種方法需要一些手工操作來確保完全的轉(zhuǎn)化，并通過計(jì)算分析來繪制圖譜。在2012年2月份，英國(guó)Oxford Nanopore Technologies的科學(xué)家提出，單分子納米孔測(cè)序可替代這種勞動(dòng)密集型的技術(shù)，測(cè)序儀能直接分辨出未修飾的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。當(dāng)核酸外切酶消化單鏈DNA后，單個(gè)堿基落入孔中，它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用，并阻礙了穿過孔中的電流。每個(gè)堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振幅，因此很容易轉(zhuǎn)化成DNA序列。這樣，納米孔技術(shù)就能直接讀出這第五種堿基。由于納米孔測(cè)序僅限于短的寡核苷酸，因此全基因組測(cè)序還有一段很長(zhǎng)的路要走。此外，還有一些技術(shù)障礙需要克服，比如確保堿基以正確的次序進(jìn)入納米孔，然后從另一側(cè)離開。不過，一旦成功，第五種堿基的直接測(cè)序?qū)?huì)產(chǎn)生重大影響。